随着世界人口的增长和生态环境的恶化，重大流行病毒爆发和新病毒的出现频率不断增加，给社会造成恐慌和巨大的经济损失。由于许多病毒的侵染途径与致病机制尚不清楚,抗病毒药物以及疫苗的研制严重滞后，因此病毒感染的防治工作面临着严峻地挑战。近年来，光学成像技术已经成为现代生物医学领域中研究病毒侵染的重要技术手段。然而，目前可用于病毒标记示踪的方法均因操作复杂或病毒活性降低等问题而难以推广应用。相反，通过纳米生物医学技术却为可视化研究病毒的侵染过程提供了可能。
中国科学院深圳先进技术研究院蔡林涛研究员团队以流感类病毒颗粒（H5N1p）与杆状病毒（Baculovirus）为模型，利用量子点等纳米荧光标记物通过生物正交化学（Bioorthogonal chemistry）对病毒进行无损标记，并在活体水平对病毒实现动态示踪，监测其侵染行为。该研究针对活病毒标记与活体示踪存在病毒活性减弱与动态可视化困难的瓶颈，通过合成具有良好生物相容性的生物代谢探针，发展一系列基于生物正交反应的荧光标记技术，在宿主体内成功实现对活病毒的高效、特异、无损的原位标记，从而最大限度地保存病毒的侵染能力；同时，运用活体示踪技术，动态监测病毒在感染组织中的侵染途径，筛选与评估抗病毒药物活性，并结合病毒定位和分子生物学手段，进一步揭示了病毒与宿主间的相互关系，为全面解析病毒的致病机制提供重要的理论依据和技术手段。这一系列研究成果先后发表在J. Am. Chem. Soc., ACS Nano, Small等国际重要期刊上发表。
目前，病毒荧光探针标记普遍存在荧光容易淬灭，不能长时间检测的难题，研究团队采用咪唑多聚物配体为修饰剂，一步法合成携带报告基团量子点（N3-QDs）,并通生物正交反应与配对基团连接的杆状病毒（DBCO-Bac）形成稳定的共价连接。运用激光共聚焦显微镜可长时间监测杆状病毒在细胞内的运动情况，直至病毒感染48 h后报告基因在感染细胞中表达，量子点仍具有很强的荧光信号（图1）。该量子点粒径小（～12 nm），光学特性优良，生物相容性好，是一种理想的纳米荧光探针；同时，病毒与量子点通过生物正交连接形成稳定的共价键，因而具备很好的特异性与稳定性。这些技术特性可以使研究者有更长的时间在细胞水平持续监测病毒复杂的感染行为。
鉴于在细胞水平上示踪病毒，所获得信息量比较有限，实验数据也不能真实反映病毒在病人体内的感染情况，因此病毒在活体水平上的示踪研究显得十分重要。该研究团队以Balb/c小鼠为感染模型，在上述基础上通过合成一种叠氮修饰的近红外量子点（NIR N3-QDs 750nm）并通过生物正交反应连接到流感类病毒颗粒表面，运用活体成像技术对流感病毒颗粒在肺部的侵染过程进行动态示踪。研究结果显示，在小鼠肺部有很强的量子点荧光信号并且与病毒颗粒完全共定位。在小鼠体内检测量子点荧光信号的位置与强度能够很好的示踪并定量病毒，这一结果得到了电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量与组织免疫荧光共定位的证实(图2)。同时，该病毒活体示踪模型还可用于抗病毒药（达菲）与抗血清治疗效果的评价工作，将来可发展为一种抗病毒药物筛选与评估平台。
由于上述病毒标记都是基于病毒的直接化学修饰（DBCO修饰病毒），通常是以病毒表面的蛋白作为修饰位点，因缺乏选择性，许多与受体结合的病毒表位被覆盖，存在高剂量修饰会降低病毒活性缺点。该研究团队为克服这一问题，以细胞代谢工程与生物正交化学为基础，发展出一种全新的活体病毒原位标记与示踪技术。该技术通过病毒宿主细胞脂类代谢将胆碱衍生物（AE-Cho）的叠氮基团无损修饰到病毒囊膜表面，在肺部感染处，叠氮修饰的病毒颗粒（N3-H5N1p）与外源 DBCO-荧光探针通过特异的生物正交反应，成功将荧光探针原位标记到病毒表面，在活体水平上实现对病毒侵染过程的荧光动态示踪（图3）。该病毒标记技术运用细胞代谢修饰与体内原位标记的策略，更大程度上保存病毒的生物学活性，而传统的标记方法使病毒的侵染活性降低30%；同时，传统方法标记的病毒诱导宿主细胞因子（IL-1b，IL-6，TNF-a）的表达与病理损伤水平也出现显着下降。这种体内病毒原位标记是通过脂类代谢修饰与生物正交连接完成的，它首次在活体内实现对病毒"高保真"的标记与“时空耦合”的动态示踪，这将有助于"可视化"研究病毒－宿主间的相互作用，为深入研究病毒活体内的侵染机制提供可靠的技术手段。
该研究团队以生物正交反应作为病毒标记的技术核心，通过化学合成光学特性优良的量子点和生物探针作为荧光标记物对活病毒进行标记与示踪研究，它将病毒研究由细胞水平成像发展到活体动态示踪，由直接化学修饰演变到无损的原位代谢标记。这项技术将活病毒的可视化研究与纳米生物医学工程紧密结合，拓宽了该技术在生物医学影像的研究对象及应用范围。
生物医学工程研究与成果的转化一直以来是该研究团队的主要目标。该技术不仅在病毒示踪研究方面具有很强实用性与有效性，而且其相关产品在生物医学工程领域具有很好的转化与应用前景。潜在的产品主要包括光学性能优越的纳米荧光量子点与无损标记的生物代谢探针。基于生物正交的荧光纳米标记物（NIR N3-QDs）,由于制备工艺相对简单，产率较高，具有很高的产业与转换的潜力，在生物医学标记与影像领域有着广泛的应用市场。同时，生物代谢探针（AE-Cho）由于其高效、无损的细胞脂类代谢修饰，可广泛用于具有膜结构的生物靶标的无损修饰与标记，该产品已申请发明专利，将来也可用于公司技术转让与工业化生产。这种示踪技术及产品将来在非病毒研究领域，如肿瘤医学成像、活细胞体内示踪、分子定点标记、药物靶向治疗、干细胞示踪、肠道菌群迁移等生物医学领域也有着广阔的产业化应用前景。
科学研究的目的是为了更好的服务于探索未知领域与临床诊疗实践，我们期待这种多学科交叉碰撞出的前沿研究与应用，能尽快转化为产品并进入市场，争取更好地造福于社会大众。
致谢：该项目获得国家纳米重大科学研究计划（项目编号：2011CB933600）、国家自然科学基金（项目编号：81601552、81501591）、科技部国际合作、广东省自然科学基金研究团队、广东省纳米医药重点实验室等基金支持。
（编辑：小智）
